آزمون سمیت سلولی مطابق استاندارد ISO10993-5 و به سه روش آزمون NRU، آزمون CFU و آزمون MTT و آزمون XTT انجام میگیرد. متداول ترین روش در ارزیابی سمیت سلولی، سنجش بقای سلولی به روش MTT یا (۳-(۴,۵-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide) است.
اساس روش برای تست MTT سمیت سلولی
اساس این روش مبتنی بر شدت رنگ تولید شده در اثر فعالیت میتوکندری سلولها می باشد که در طول موج ۵۴۰ تا ۶۳۰ نانومتر اندازه گیری می شود و به طور مستقیم با تعداد سلولهای زنده متناسب است به طوری که افزایش یا کاهش تعداد سلولهای زنده به صورت خطی با فعالیت میتوکندری های سلول در ارتباط است.
رنگ تترازولیموم MTT در سلولهای فعال (به لحاظ متابولیکی)، إحیا می شود. دهیدروژنازهای میتوکندریایی در سلولهای زنده با تولید NADH و NADPH منجربه تشکیل رسوب نامحلول ارغوانی رنگ به نام فورمازان میشوند. این رسوب میتواند توسط ایزوپروپانول یا دی متیل سولفواکسید حل گردد. از سوی دیگر، سلولهای مرده، توانایی انجام این تبدیل را به دلیل فعال نبودن میتوکندری های خود نداشته و بنابراین سیگنالی را نشان نمی دهند. در این روش، تشکیل رنگ به عنوان نشانگری برای وجود سلولهای زنده مورد استفاده قرار می گیرد.
روش انجام آزمون MTT برای تست سمیت سلولی
آزمون سمیت سلولی مطابق استاندارد ISO10993-5 و به سه روش آزمون NRU، آزمون CFU و آزمون MTT و آزمون XTT انجام میگیرد. متداول ترین روش در ارزیابی سمیت سلولی، سنجش بقای سلولی به روش MTT یا (۳-(۴,۵-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide) است.
در روش MTT، جهت بررسی سمیت سلولی یک فلاسک L929 کانفلوئنس را زير هود برده و در شرايط كاملاً استريل محيط رويي سلول را خالي نموده، سپس سطح سلول ها را با PBS شست و شو داده و سپس به آن تريپسين افزوده تا سلولها از حالت كشيده و فيبروبلاستيك خارج شده و به شكل كروي در آيند.
سپس محيط ۱۰ % FBS دار (سرم جنین گاوی) روي آنها ريخته تا تريپسين خنثي شود. پس از آن سلول ها را درون لوله فالكون ريخته با دور rpm 1200 به مدت ۵ دقيقه سانتريفوژ مي شوند كه سلول ها از محيط جدا شده و در كف فالكون قرار گيرند.
سپس لوله فالكون را از سانتريفوژ خارج كرده و محيط رويي آن را دور ریخته و روي آن محيط ۱۰ % FBS دار ريخته و توسط لام نئوبار شمارش سلولی انجام می شود. به ازای هر خانه یک پلیت ۲۴ خانه ای به میزان ۱۰۴*۵ سلول در نظر گرفته می شود.
نمونه های استریل نیز در شرایط استریل در مرکز هر خانه از پلیت قرار داده و سوسپانسیون سلولی به آن اضافه می شود و به مدت ۲۴ ساعت در انكوباتور C37 و Co2 5 % قرار داده می شود. طبق استاندارد ISO 10993-5 پس از ۲۴ ساعت، محیط رویی سلول را برداشته و با PBS لایه سلولی شست و شو داده می شود و سپس محلول MTT (1mg/ml) به میزان کافی روی لایه سلولی ریخته می شود.
پلیت کشت به مدت ۳-۵ ساعت درون انکوباتور در تاریکی قرار می گیرد. پس از مدت زمان گفته شده سلول ها با PBS شست و شو می شود تا MTT واکنش نکرده خارج شود. محصول فرمازان ایجاد شده توسط حلال ایزوپروپانل حل می شود و جذب هر خانه در طول موج ۵۴۰ نانومتر خوانده می شود. میزان مانایی سلول (Cell Viability) حاصل کسر جذب هر نمونه بر نمونه کنترل (ظرف پلی استایرن) است.
محاسبه درصد سلولهای زنده در تست سمیت سلولی
درصد سلولهای زنده یا میزان بقای سلولی در بررسی سمیت سلولی، بر اساس رابطه زیر محاسبه می‌گردد:
۱۰۰ × جذب متوسط نمونه‌های کنترل / جذب متوسط نمونه‌های تیمار شده = درصد سلولهای زنده