اساس روش برای تست MTT سمیت سلولی
اساس این روش مبتنی بر شدت رنگ تولید شده در اثر فعالیت میتوکندری سلولها می باشد که در طول موج ۵۴۰ تا ۶۳۰ نانومتر اندازه گیری می شود و به طور مستقیم با تعداد سلولهای زنده متناسب است به طوری که افزایش یا کاهش تعداد سلولهای زنده به صورت خطی با فعالیت میتوکندری های سلول در ارتباط است.
رنگ تترازولیموم MTT در سلولهای فعال (به لحاظ متابولیکی)، إحیا می شود. دهیدروژنازهای میتوکندریایی در سلولهای زنده با تولید NADH و NADPH منجربه تشکیل رسوب نامحلول ارغوانی رنگ به نام فورمازان میشوند. این رسوب میتواند توسط ایزوپروپانول یا دی متیل سولفواکسید حل گردد. از سوی دیگر، سلولهای مرده، توانایی انجام این تبدیل را به دلیل فعال نبودن میتوکندری های خود نداشته و بنابراین سیگنالی را نشان نمی دهند. در این روش، تشکیل رنگ به عنوان نشانگری برای وجود سلولهای زنده مورد استفاده قرار می گیرد.
روش انجام آزمون MTT برای تست سمیت سلولی
آزمون سمیت سلولی مطابق استاندارد ISO10993-5 و به سه روش آزمون NRU، آزمون CFU و آزمون MTT و آزمون XTT انجام میگیرد. متداول ترین روش در ارزیابی سمیت سلولی، سنجش بقای سلولی به روش MTT یا (۳-(۴,۵-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide) است.
در روش MTT، جهت بررسی سمیت سلولی یک فلاسک L929 کانفلوئنس را زير هود برده و در شرايط كاملاً استريل محيط رويي سلول را خالي نموده، سپس سطح سلول ها را با PBS شست و شو داده و سپس به آن تريپسين افزوده تا سلولها از حالت كشيده و فيبروبلاستيك خارج شده و به شكل كروي در آيند.
سپس محيط ۱۰ % FBS دار (سرم جنین گاوی) روي آنها ريخته تا تريپسين خنثي شود. پس از آن سلول ها را درون لوله فالكون ريخته با دور rpm 1200 به مدت ۵ دقيقه سانتريفوژ مي شوند كه سلول ها از محيط جدا شده و در كف فالكون قرار گيرند.
سپس لوله فالكون را از سانتريفوژ خارج كرده و محيط رويي آن را دور ریخته و روي آن محيط ۱۰ % FBS دار ريخته و توسط لام نئوبار شمارش سلولی انجام می شود. به ازای هر خانه یک پلیت ۲۴ خانه ای به میزان ۱۰۴*۵ سلول در نظر گرفته می شود.
نمونه های استریل نیز در شرایط استریل در مرکز هر خانه از پلیت قرار داده و سوسپانسیون سلولی به آن اضافه می شود و به مدت ۲۴ ساعت در انكوباتور C37 و Co2 5 % قرار داده می شود. طبق استاندارد ISO 10993-5 پس از ۲۴ ساعت، محیط رویی سلول را برداشته و با PBS لایه سلولی شست و شو داده می شود و سپس محلول MTT (1mg/ml) به میزان کافی روی لایه سلولی ریخته می شود.
پلیت کشت به مدت ۳-۵ ساعت درون انکوباتور در تاریکی قرار می گیرد. پس از مدت زمان گفته شده سلول ها با PBS شست و شو می شود تا MTT واکنش نکرده خارج شود. محصول فرمازان ایجاد شده توسط حلال ایزوپروپانل حل می شود و جذب هر خانه در طول موج ۵۴۰ نانومتر خوانده می شود. میزان مانایی سلول (Cell Viability) حاصل کسر جذب هر نمونه بر نمونه کنترل (ظرف پلی استایرن) است.
محاسبه درصد سلولهای زنده در تست سمیت سلولی
درصد سلولهای زنده یا میزان بقای سلولی در بررسی سمیت سلولی، بر اساس رابطه زیر محاسبه میگردد:
۱۰۰ × جذب متوسط نمونههای کنترل / جذب متوسط نمونههای تیمار شده = درصد سلولهای زنده
سميت سلول(Cytotoxicity) : عوامل شيميائی و بيولوژيکی که باعث مرگ سلول می شوند.
آزمون سمیت سلولی چیست (Cytotoxicity assay)؟
آزمايش برون تنی جهت اندازه گيری ميزان مرگ ومير و زنده مانی سلول در کشت سلولی در مجاورت و يا همکشتی با وسايل و تجهيزات پزشکی و آرايشی بهداشتی و همچنين فرآوردهای بيولوژيک. طبق پروتوکل استاندارد.
کشت آزمايشگاهی سلول و سميت سلولی:
استفاده از سلولهای پستانداران. کشت سلول پستانداران (جانوران و انسان، برای مثال سلول فيبروبلاست موشی با کد L929) بصورت انبوه و استفاده آنها برای ارزيابی سميت سلولی با نمونه مورد آزمايش.
- آزمون کيفی سميت سلولی (مورفولوژی سلول):
کشت سلول و در مجاورت قراردان نمونه مورد آزمايش بصورت مستقيم در تماس فيزيکی (همکشتی) و يا با اضافه کردن عصاره بدست آمده از نمونه مورد آزمايش در محيط کشت سلول. ارزيابی آسيب سلولی در زير ميکروسکوپ معکوس. تغييرات ظاهری سلول (گرد شدن) و ساير موارد غير عادی و همچنين عدم تکثير و ازدياد سلول نشانگر آسيب سلولی است.
- آزمون کمی سميت سلولی (در صد زنده مانی) :
کشت سلول با همان روش کيفی که اشاره شد سلول ها کشت داده می شوند در مجاورت نمونه مورد آزمايش و ارزيابی آسيب سلولی بوسيله روش کمی ازدياد سلولی با استفاده از شدت رنگ آميزی بوسيله تترا زوليوم (MTT) انجام می شود.
yellow tetrazolium MTT (3-(4, 5-dimethylthiazolyl-2)-2, 5-diphenyltetrazolium bromide
علاوه بر آن روش Neutral Red Uptake (NKA) نيز قابل اجرا است.لذا روش MTT روش استاندارد و قابل قبولی توسط آزمايشگاه های مرجع می بلاشد. در روش MTT ميزان افزايش کريستال ارغوانی تترا زوليوم بوسيله فعاليت سلولی نشانگر ازدياد سلولی است که با خوانش جذب نوری بصورت کمی درصد زنده مانی سلول و بخصوص فعاليت فيزيولوژيکی سلول و ازدياد آنرا نشان اثبات می کند.
آزمایشات کشت سلول و ارزيابی سمیت سلولی در آزمایشگاه های مخصوص کشت سلولی در شرايط بسيار تميز و در زير هود بيولوژی و کاملاٍ استريل انجام می شود. برای دریافت اطلاعات دقیق می توانید با ما تماس بگیرید.
آزمون های سمیت سلولی:
آزمایشهای سمیت سلولی در استانداردهای ISO ، آزمایشهای زیست سازگاری اولیه هستند که در محدوده ارزیابی وسايل و تجهيزات بهداشتی و پزشکی انجام میشوند. آزمایش سمیت سلولی در شرایط آزمایشگاهی امکان تشخیص کمی و کیفی تکثیر سلولهای در حال تعامل با تجهيزات پزشکی را در شرایط آزمایشگاهی یا اثرات کشنده سميت سلولی آنها بر سلولها را فراهم میکند. برای این منظور، مستقیماً با نمونه مورد آزمايش پزشکی استفاده می شود و اثر سميت سلولی که ممکن است در نتیجه برهمکنش با موادی که ممکن است از نمونه نشت کند رخ دهد و یا عصاره های به دست آمده از نمونه های پزشکی با استفاده از حلال هایی که پتانسیل برخورد با قطب، غیرقطبی یا هر دو را دارند.
آزمایشات کيفی غير مستقيم با استفاده از لايه آگار و نفوذ پذيری از طريق آگار به کشت سلول جهت دستيابی به ميزان سميت نمونه می باشد و از اين طريق نفوذ پذيری و شدت سميت سلولی محاسبه می گردد. در آزمایش نشتی آگار، یک لایه آگار بر روی سلول های فیبروبلاست L929 رشد کرده در ظروف کشت سلولی (پتری ديش) ایجاد می شود. موادی که از نمونه مورد پزشکی تهيه شده مستقیماً روی آگار و یا عصاره گرفته شده قرار داده خواهد شد. مواد نمونه از لایه آگار عبور کرده و به سلول ها می رسد و ممکن است با سلول ها تعامل داشته باشد و اثرات کشنده ای از خود نشان دهد. این اثرات به صورت نیمه کمی ارزیابی می شوند.
انجام آزمايشات در محدوده استاندارد ISO پذیرفته شده است و توسط پرسنل متخصص در آزمایشگاه کشت سلولی انجام می شود. اینکه کدام یک از این آزمایشات انجام شود می تواند مورد تقاضای مشتری و توسط آزمایشگاه ما پیشنهاد شود.
بسته به ماهیت محصول، یکی از این آزمایش ها یا در صورت لزوم بیش از یک آزمایش برای ارزیابی سمیت سلولی دستگاه پزشکی انجام می شود.
در آزمایشگاه های نیکوفارمد ، مطالعات سمیت سلولی ما بر روی فیبروبلاست و رده های سلولی مختلف در صورت درخواست مشتری توسط کارشناسان ما بر اساس نوع محصول انجام می شود. مطالعات سمیت سلولی در محدوده تجهیزات پزشکی آزمایشی است که باید روی تمام محصولاتی که نیاز به آزمایش زیست سازگاری دارند انجام شود. این یکی از آزمایش های اولیه است که در ارزیابی زیست سازگاری انجام می شود. عملکرد آزمایش و قابلیت اطمینان نتایج آن بسیار مهم است زیرا به عنوان مرجعی عمل می کند که سایر تست های زیست سازگاری را روشن می کند. به همین دلیل، آزمایشگاه ما، که دارای اعلامیه انطباق GLP که بعنوان یک گواهی کیفیت مهم است، این اطمینان را به مشتریان خود پيشنهاد می کند.
لطفا برای اطلاعات بیشتر با ما تماس بگیرید.
تست های زیست سازگاری چیست؟
زیست سازگاری قبول يک کاشت مصنوعی بوسيله بافت و بدن بطور کل. یک ماده با سازگاری فیزیکی، شیمیایی و بیولوژیکی بافت ها و رفتار مکانیکی بدن است. زیست سازگاری توانایی مواد در مقابل پاسخ مناسب از بدن است. مهم ترین زنجیره فرآیندهای ارزیابی انطباق، تست های زیست سازگاری است.
بیومواد طبیعی و یا مصنوعی موادی هستند که برای انجام و یا پشتیبانی از عملکرد بافتهای زنده در بدن انسان استفاده میشوند. تلاش های فشرده ای برای توسعه مواد جدید برای این منظور در حال انجام است.
بیومواد طراحی شده برای کاشت در یک سیستم زنده و به طور جزئی یا کامل بر عملکرد اندام ها و بافت ها باید از نظر بیولوژیکی سازگار، غیر سمی (غير سرطان زا، بدون سميت ژنی، بدون حساسيت زائی، بدون تحريک زائی و ....) واز نظر شیمیایی بی اثر و پایدار باشد، از استحکام مکانیکی کافی برخوردار باشد، بتواند خود را با زندگی پرمشغله وفق دهد و وزن و چگالی مناسبی داشته باشد. علاوه بر این، لازم است که خواص فیزیکی، شیمیایی، مکانیکی و حرارتی آن به خوبی شناخته شده باشد و بدون و يا کمترين عوارض جانبی. برای تمامی این ویژگی ها، باید با در نظر گرفتن ماهيت لوازم پزشکی، آزمایشاتی را که باید انجام شود، مشخص کرد.
زیست سازگاری دستگاه های پزشکی توسعه یافته در این زمینه با بافت های انسانی تنها در نتیجه آزمایش های انجام شده مشخص می شود.
شرکت ما دارای یک مرکز تولید حیوانات آزمایشگاهی، آزمایشگاه تحقیق و توسعه، آزمایشگاه کشت سلولی و آزمایشگاه هیستوپاتولوژی است. تمام آزمایشات در آزمایشگاه های مرکز خود ما انجام می شود.